BeaverBeads? His-tag Protein Purification用于免疫印跡或考馬斯藍(lán)染色分析
該研究將細(xì)菌表達(dá)的His標(biāo)記的TMED2截短體（His-TMED2）與BeaverBeads? His偶聯(lián)，然后與表達(dá)F-MITA截短體的HEK293細(xì)胞提取物一起孵育。通過(guò)用SDS上樣緩沖液煮沸洗脫與磁珠結(jié)合的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了免疫印跡或考馬斯藍(lán)染色分析。
武漢大學(xué)劉昱教授等在出版于Cell Reports 8.032的通過(guò)加強(qiáng)MITA二聚化和促進(jìn)TMED2販運(yùn)，增強(qiáng)細(xì)胞IFN對(duì)DNA病毒的反應(yīng)中總結(jié)：
由于MITA在天然免疫識(shí)別胞質(zhì)異常DNA的信號(hào)通路中的重要作用，其表達(dá)和活化的調(diào)控機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。該研究發(fā)現(xiàn)，TMED2通過(guò)增強(qiáng)MITA的二聚化、促進(jìn)MITA從核糖體向ER上的轉(zhuǎn)位、促進(jìn)MITA從ER向核周小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)抗DNA病毒天然免疫反應(yīng)。
該研究將細(xì)菌表達(dá)的His標(biāo)記的TMED2截短體（His-TMED2）與BeaverBeadsTM His偶聯(lián)，然后與表達(dá)F-MITA截短體的HEK293細(xì)胞提取物一起孵育。通過(guò)用SDS上樣緩沖液煮沸洗脫與磁珠結(jié)合的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了免疫印跡或考馬斯藍(lán)染色分析。
研究人員發(fā)現(xiàn)敲低或敲除TMED2明顯抑制HSV-1感染誘導(dǎo)的MITA二聚化以及轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB的活化，降低I型干擾素和炎癥因子的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄；在TMED2敲除的細(xì)胞中HSV-1復(fù)制也明顯增加，表明TMED2促進(jìn)抗DNA病毒天然免疫信號(hào)通路。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)HSV-1感染誘導(dǎo)內(nèi)源性TMED2與MITA在ER腔內(nèi)發(fā)生相互作用。TMED2通過(guò)增強(qiáng)MITA與轉(zhuǎn)位復(fù)合體關(guān)鍵成分TRAPβ的相互作用，促進(jìn)MITA翻譯后從核糖體向ER轉(zhuǎn)位；TMED2也通過(guò)強(qiáng)化MITA與COPII復(fù)合物成分Sec24C的相互作用，促進(jìn)MITA經(jīng)COPII復(fù)合物組裝，由ER向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)。
該論文發(fā)現(xiàn)了MITA信號(hào)通路的新調(diào)控分子TMED2，并解析了其作用機(jī)制，為構(gòu)建天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要支持，也為篩選抗病毒藥物的分子靶點(diǎn)提供線(xiàn)索。
圖 免疫印跡及考馬斯藍(lán)染色分析
